Апоптоз стимуляция рецепторов тимоциты

Апоптоз и фактор некроза опухолей (TNF, ФНО)

Установлено [ Laster ea 1988 ], что связывание ФНО со специфическими рецепторами вызывает апоптоз в некоторых типах клеток. Так, в частности, было показано [ Никонова ea 1991 ], что при инкубации тимоцитов с ФНО-а в течение 18ч гибель клеток усиливается, а пролиферация их угнетается. Усиление гибели клеток авторы связывают с действием фактора на кортикальные тимоциты, имеющие рецептор для агглютинина арахиса. Прямых доказательств гибели клеток по типу апоптоза в данной работе не приведено, хотя авторы не исключают, что ФНО-а, который может продуцироваться внутри тимуса макрофагами, дендритными и другими клетками, причастен к реализации массовой гибели кортикальных тимоцитов. В работе [ Defresne ea 1990 ] изучено влияние ФНО на лимфоэпителиальные взаимоотношения в тимусе. Показано, что рекомбинантный ФНО человека влияет на тимические "клетки-няньки". ФНО-а стимулировал эпителиальные клетки из комплекса "клетки-няньки" к взаимодействию с незрелыми тимоцитами in vitro и к образованию новых лимфоэпителиальных комплексов. Рекомбинантный ФНО-а не влиял на экспрессию la-антигена в культуре моноцитов и предотвращал гибель этих клеток, которая наблюдалась при их культивировании без фактора [ Mangan ea 1991 ].

ФНО-а предотвращал апоптоз, вызванный антииммуноглобулиновыми антителами в клетках лимфомы Беркита линии Ramos [ Liu ea 1994 ]. ФНО-а индуцировал апоптоз в человеческой лейкемической линии MOLT-16, экспрессирующей bcl-2 и c-myc. Экспрессия этих онкогенов изменялась после воздействия ФНО-а: c-myc mRNA - понижалась, a bcl-2 mRNA - повышалась [ Dao ea 1994a ]. При индукции апоптоза ФНО происходит активация внутриклеточных протеаз [ Voelkeijohuson ea 1995 ]. В других клеточных типах ФНО вызывает активацию и дифференцировку.

В клетках некоторых типов TNF индуцирует апоптоз при посредстве TNFR1. Однако в противоположность случаю с CD95L, TNF редко запускает апоптоз, если только синтез белка не блокирован, что наводит на мысль о том, что существуют какие-то специальные клеточные факторы, которые могут подавлять апоптические стимулы, генерируемые TNF. Экспрессия этих подавляющих белков возможно контролируется через NF-kB и JNK / AP-1. поскольку ингибиция любого из этих путей увеличивает чувствительность клетки к индукции апоптоза осуществляемой под действием TNF [ Beg ea 1998 ]. TNF настраивает TNFR1 при связывании [ Smith ea 1995 ], индуцируя ассоциацию рецепторных доменов смерти ( Рис. 2 ). Вслед за этим, адаптер, называемый TRADD (TNFR-associatrd death domain) [ Hsu ea 1995 ] связывается при посредстве своего собственного домена смерти с кластерированными доменами смерти рецепторов. TRADD работает как единый адаптер который привязывает несколько сигнальных молекул к активированному рецептору. Связанный с TNFR factor 2 ( TRAF2 ) [ Rothe ea 1995. Hsu ea 1996 ] и взаимодействующий с рецептором белок RIP (receptor-interacting protein) [ Hsu ea 1996 ] стимулируют пути, ведущие к активации NF-kB и JNK/AP-1. в то время как FADD приводит к активации апоптоза [ Hsu ea 1996. Chinnaiyan ea 1996 ].

В организме здорового человека клеточный гомеостаз определяется балансом между гибелью и пролиферацией клеток. Апоптоз - программированная клеточная гибель, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами и избавляет организм от ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут.

Апоптоз – это биохимически специфический тип гибели клетки, который характеризуется активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, которые расщепляют ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец (“апоптотические тельца”), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Это энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Он играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов. При снижении апоптоза происходит накопление клеток, пример – опухолевый рост. При увеличении апоптоза наблюдается прогрессивное уменьшение количества клеток в ткани, пример – атрофия.

Морфологические проявления апоптоза

Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз – в отличие от некроза – никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.

Таблица 1. Сравнительная характеристика некроза и апоптоза

Автономный механизм апоптоза 12

Снижение апоптоза 14

Ускорение апоптоза 15

Значение апоптоза в развитии организма и патологических процессах 15

Источник информации:

В организме здорового человека клеточный гомеостаз определяется балансом между гибелью и пролиферацией клеток. Апоптоз - программированная клеточная гибель, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами и избавляет организм от ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут.

Апоптоз - это биохимически специфический тип гибели клетки, который характеризуется активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, которые расщепляют ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец (“апоптотические тельца”), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Это энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Он играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов. При снижении апоптоза происходит накопление клеток, пример - опухолевый рост. При увеличении апоптоза наблюдается прогрессивное уменьшение количества клеток в ткани, пример - атрофия.

Морфологические проявления апоптоза

Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз - в отличие от некроза - никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.

Таблица 1. Сравнительная характеристика некроза и апоптоза

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Апоптоз нормальных и трансформированных лимфоцитов при взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса in vitro

Автореферат диссертации по медицине на тему Апоптоз нормальных и трансформированных лимфоцитов при взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса in vitro

^.Улч Па правах рукописи

КУДАГЯН Валим Маратович

диссертации яа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1996 год

Работа выполнен» в Институте иммунологии Минздравмедпрома Российской

Научный руководитель:

академик ЛЕН. докюр медицинских наук, профессор А. А.Ярилин

Официальные оппоненты:

член-Kopp. АБН, до»тор медицинских наук, профессор В. М.Земсхов доктор биологических наук Е. И.Асташкнн

Ведущая организации: Московская медицинская академия им. И. М.Сеченова

Защита состоится 26 июня 1996 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ по адресу: 115478, Москва, Каширское ш. д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Автореферат разосла н 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л. С.Сеславина

Актуальность темы

Поддержание гомеосгаза в макроорганизме достигается благодаря контролю над постоянными процессами пролиферации, дифференцировки и гибели соответствующих клеток. Понимание клеточной смерти как активного процесса, развивающегося в четком соответствии с заложенной в каждой клетке программой "самоубийства" привело к возникновению повышенного интереса к данному феномену в последние годы. Количество исследований, посвященных этому вопросу, растет лавинообразно, указывая на важность программной клеточной гибели или апоптоза в различных биологических процессах. Программная элиминация клеток играет важную роль в нормальном развитии тканей и органов в период эмбриогенеза, метаморфоза, гормон-зависимого тканевого роста и атрофии, в созревании лимфоцитов, а также в возникновенин и росте злокачественных новообразований.

Т-лимоциты играют ключевую роль в иммунном надзоре, то есть в распознавании и элиминации чужеродных или собстиеииых клеток, измененных вследствии опухолевой трансформации или инфицирования вирусами и другими внутриклеточными агентами. Осуществление этой роли достигается благодаря распознаванию Т-клеткамн модификации аутологичных молекул главного комплекса гнстосовместимосги вследствии их комплексирования с пептидными фрагментами чужеродных белков (вирусных, опухолеассоциированных и т. д.). Формирование способности Т-лимфоцитов распознавать свое и чужое и дифференцироваться в функционально-активные клетки происходит в тимусе благодаря процессам позитивной и негативной селекции (Ярилин и соавт. 199. von Boehmer, 1994; Nossal, 1994). Данные процессы осуществляются под влиянием факторов микроокружения тимуса, под которыми понимают клетки, с которыми контактируют созревающие тимоциты и их гуморальные продукты (Kendall, 1991). К клеткам тимусною мнкроокружения относят эпителиальные, дендритные, миоидные клетки, макрофаг и, фибробласты и т. д. Важнейшими среди них считают эпителиальные клетки, которые вступают с тимоцитами в контакты и даже поглощают их внутрь и обволакивают отростками мембраны, а также выделяют ряд продуктов, как близкодействующих (цитокины), так и поступающих в кровоток (гормоны). Считается, что положительную селекцию тимоцитов осуществляют эпителиальные клетки тимуса, тогда как за осуществление

процессов элиминации потенциально аутореактогенных клонов предположительно ответственны дендритные клетки. Расшифровка сигналов, которыми обмениваются между собой эпителиальные клетки и тимоциты, позволит не только понять процесс развития Т-лимфоцитов, их функционального и клонального разнообразия, но и контролировать эти процессы и корригировать их в случае патологии.

Ранее в Институте иммунологии МЗ МП РФ была получена линия эпителиальных клеток из тимуса ребенка, получившая название HTSC (Sharova et all. 1993). Признаком эпителиальной природы является наличие в них кератина. Клетки HTSC экспрессируют на своей поверхности молекулы МНС I и II класса. В монокультуре они не пролиферируют и практически не выделяют гуморальных продуктов. При совместном культивировании с человеческими тимоцитами и активированными периферическими Т-лимфоцитами наблюдается активация клеток HTSC и секреция ими ряда цитокинов и гормонов тимуса, включая ai-тимозин. С другой стороны, в совместной культуре эпителиальных клеток и тимоцитов последние подвергаются апоптозу и исчезают к 3-4 суткам культивирования (Yarilin, Sharova, 1995). Можно предположить, что взаимодействие между эпителиальными клетками и Т-лимфоцитами in vitro моделирует аналогичные процессы, происходящие при селекции тимоцитов в тимусе in vivo, а данная система является удобной моделью для изучения гуморальных и клеточных сигналов и факторов, имеющих место при взаимодействии эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в изучении на примере клеточной линии HTSC способности эпителиальных клеток тимуса индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов и анализе природы контактных и гуморально-оносредованных сигналов, обусловливающих апоптоз тимоцитов и зрелых Г-лимфоцитов при их взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса.

В соответствии с этой целью в работе решались следующие ЗАДАЧИ:

1. Анализ взаимодействия различных фракций тимоциюв с эпителиальной клеточной линией тимуса HTSC; установление взаимосвязи стадии дифференцировки тимоцитов и подверженности их апоптозу при взаимодействии с HTSC.

2. Анализ взаимодействия зрелых периферических лимфоцитов доноров с HTSC; эффективность митогенов различной направленности действия в индукции апоптоза активированных лимфоцитов эпителиальными клетками тимуса.

3. Изучение иозможносш индукции апоптоза трансформированных лимфоцитов больных лимфолейкозами и перевиваемых клеточных линий при взаимодействии с ШЪС.

4. Изучение роли Газ-антигена в НТЗС'-индуцнрованном апоптозе лимфоцитов.

5. Анализ значения контактных и гуморальных взаимодействий между тнмоцитами и клетками НГ8С в индукции апоптоза тнмоцитов; роль пар молекул С04-МИС-П; С13К-МНС-1, С02-С05Н; ЬРА-1-1САМ-1 в НТЗС-опосредованном апоптозе.

6. Ингибиторный анализ Н'18С-индуцированного апоптоза; эффект ингибиторов синтеза ДНК, РНК, белка, блокаторов микротрубочек и микрофиламентов.

7. Сопоставительный анализ апоптоза, вызванного клетками НТБС и другими факторами (облучением, глкжокортнкоидамн).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ: Впервые исследовано взаимодействие лимфоидных и эпителиальных клеток тимуса в культуре с выяснением природы сигналов, обусловливающих индукцию апоптоза первых и активацию последних, а также анализом некоторых механизмов этих процессов. Данная работа вносит свой вклад в понимание природы процессов развития Т-кдеток (в частности, селекции тимоцнтов и некоторых возможных механизмов, способных индуцировать программированную гибель периферических Т-лимфоцитов), взаимодействий между эпителиальными и лимфоидными клетками, особенностей сигналов, приводящих к активации и апоптозу клеток, соотношения контактных и гуморальных факторов в их осуществлении.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Работа вносит существенный вклад в развитие общей иммунологии, а также медицины, обогащая их пониманием нскоюрмх этапов развития Т-клсток и особенностей взаимодействия последних с эпителиальными клетками тимуса.

Сделаны первые шаги в понимании природы сигналов, способствующих индукции апоптоза в трансформированных Т-лимфоцитах, что может явиться основой для дальнейшего изучения сигналов и факторов, способствующих данному процессу, и иметь важное практическое значение для возможности использования этих факторов в терапии лимфолейкозов.

Разработанная тест-система in vitro может быть использована при тестировании активности препаратов, в том числе для оценки действия фармакологических агентов на развитие лимфоцитов в тимусе, чувствительность Т-клеток к индукции апоптоза и выработку гормонов и цитокинов эпителиальными клетками.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Эпителиальные клетки тимуса линии HTSC вызывают апоптоз предшественников Т-лимфоцитов (дубль-негативных (CD4-CD8-) и дубль-позитивных (CD4+CD8+)) и не вызывают апоптоз зрелых (CD4-CD8+ и CD4+CD8-) тимоцитов.

2. Клетки HTSC индуцируют апоптоз активированных периферических Т-лимфоцитов доноров, лимфоцитов больных Т-лимфолейкозами и клеток перевиваемых Т-клеточных линий.

3. Супернатанты от активированных HTSC вызывают апоптоз тимоцитов и Т-лимфоцитов.

4. Моноклональные антитела (МоДт) к CD95 (Fas, АРО-1), экспрессированному на поверхности тимоцитов и активированных Т-клеток, индуцируют апоптоз этих клеток; предварительная обработка МоАт к CD95 Т-клеток ведет к блокаде HTSC-индуцированного апоптоза последних.

5. МоАт, блокирующие взаимодействие между парами молекул LFA-1/1САМ-1 и CD8/MHC-I на поверхности тимоцитов и эпителиальных клеток соответственно ведут к отмене HTSC-опосредованиого апоптоза.

6. Ингибиторы синтеза ДНК, РНК и белка блокируют HTSC-индуцированный апоптоз.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Диссертация апробирована на заседании секции N2 Ученого Совета Института иммунологии. По материалам работы опубликовано печатные работы.

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, содержит рисунка и таблицы. В списке литературы источника, из них - отечес твенных анюрон.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Линия эпшелиальнмх клетк стромы тимуса человека (HTSC) была любезно предоставлена к. б.н. ведущим научным сотрудником лаборатории дифференцировки лимфоцитов Института иммунологии МЗ МП РФ Н. И.Шаровой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли из гепаринизированной венозной крови на градиенте плотности фиколла-верографина ("Pharmacia") центрифугированием при 400g в течение 30 мин. Клеточную суспензию забирали из интерфазы и трижды отмывали средой 199 по 10 мин при 200g. Клетки ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из среды RPMI 1640 ("Flow Labs") с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ИЭМ им. Н. Ф.Гамалеи), 2 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES ("Flow Labs") и 80 мкг/мл гентамицмна ("Pharmachim").

Источником тнмоцитов служили дольки тимуса, удаленные в ходе сердечно-сосудистой операции для облегчения доступа к сердцу у детей не старше 5 лет. Дольки тимуса измельчали в гомогенизаторе, эритроциты и нежизнеспособные клетки удаляли центрифугированием на градиенте фиколла-верографина как описано выше, клеточную суспензию ресуспендировали в ПКС.

Для фракционирования тнмоцитов нами использовался классический метод пеннинга (отрицательная селекция) с некоторыми модификациями. Селекцию проводили на пластиковых чашках Петри диаметром 90 мм ("Медполимер"). Использовали среду 199 с 0.2% ЭТС для уменьшения неспецифической адгезии. Принципиальная схема фракционирования представлена на рис 1.

В чацпси Петри вносили по S-8 мл кроличьей антисыворотки против иммуноглобулинов мыши в 0,) М бикарбонатом буфере (рН 8,6) (концентрация белка составляла 25-50 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 4° С или при 37° С в течение 1 часа, удаляли антисыворотку, дважды ополаскивали чашки и вносили по 5 мл среды с ЭТС на 30 мин при комнатной температуре для снижения неспецифической адгезии клеток. По истечении срока, вносили 4-5 мл клеток в концентрации 2-4* Ю'/мл. Клетки предварительно обрабатывали мышиными МоАт против поверхностных маркеров, согласно схеме на рис. 1 в течение I часа при 4° С (рабочее разведение антител 1:200 на 5*10* клеток). Чашки Петри с клеточной суспензией инкубировали 40-45 мин при комнатной

Схема негативной селекции тимоцитов

легкая фракция (р= 1,066) обогащенная кортикальными тимо(|пастами

обработка МоАт к CD3, CD4, CD8

style="display:inline-block;width:300px;height:250px"
data-ad-client="ca-pub-6667286237319125"
data-ad-slot="5736897066">